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【文献】色谱法：天然药物研发的重要工具
出自识林
2020-03-06
2020年1月，来自印度印度科学与工业研究理事会（CSIR）-印度中西医研究所（IIIM）的Alamgir Ahmad Dar博士在《分离科学杂志》（Journal of Separation Science）杂志上发表了一篇名为Chromatography: An important tool for drug discovery的综述文章，对色谱分析方法在天然产物（NPs）药物研发过程中的应用进行了详细阐释。
NPs，一般指具有生物活性并来源于自然资源（例如植物、动物和微生物）的化学实体。从NPs中筛选具有活性的化合物或者苗头化合物，再将其优化成先导化合物，进而构建具有治疗效果的新化合物，是目前以NPs为基础的天然药物研发的主要途径。与人工合成的化合物库相比，NPs具备不可比拟的复杂性和多样性，对于药物研发具有很强的指导意义。据估计，1981年至2006年期间新批准的药物中约有50%直接或间接地来自于NPs。
Alamgir Ahmad Dar博士表示，结合生物和药理活性筛选对NPs中的成分进行分离提取，以获得具有较高活性 的单一化合物已逐渐成为一种趋势。如下图所示，通过对NPs提取物按照不同的极性和酸碱性进行分类，分别进行生物活性和体外药理活性的筛选，可较快地识别苗头化合物，再通过硅胶柱、凝胶柱、HPLC 等方法进行分离，能显著降低锁定活性成分的时间成本。但是，这一流程也存在很多制约的因素，例如活性成分的提取过程往往是繁琐而低效的，有时必须对重要的官能团进行修饰以降低副作用或者获得更好的溶解性、特异性，有时需要制备高纯度的化合物以进行精确的结构分析或体内、体外实验，这些问题都是药物研发过程中的瓶颈。
近年来，色谱分析方法在以NPs为基础的药物研发领域应用越来越广泛。一般来说，从植物中分离、提取NPs，具体的方法有以下几种：
一、植物材料的鉴定
能够准确鉴定所研究的生物材料，无疑是NPs分离中所有步骤的关键。在药用植物领域，由于传统中药和中药制品在欧洲市场上的“走红”，使得人们对生物材料认证的必要性意识不断提高。而不论何时，与经过权威认证的植物鉴定标本库进行对比都是植物材料鉴定必不可少的先决条件。因此，任何一种材料，都应在当地权威的植物标本室内保存其鉴定标本。另外，要准确的完成植物材料的身份验证，往往可能需要几种方法的组合。
1.形态学鉴定
对药用植物来说，它的形态学和解剖学验证是分类鉴定的主要手段。但是，由于古典生药学专业的没落，具有丰富经验的分类学者和专家越来越少，对植物进行准确的形态学鉴定不容乐观。如果药用植物具有显著的解剖学特征，例如易于辨认的腺毛、草酸钙结晶等，普通的光学显微鉴定方法不失为一个有效且经济的选择。
2.高效薄层色谱法/薄层色谱法（HPTLC/TLC）鉴定方法
由于技术和设备的不断更新，TLC在活性成分分析领域一直都占有举足轻重的地位，尤其在分析中草药、膳食补充剂、临床样品、食物以及饮料等方面应用广泛。而HPTLC是TLC的进化版，其固定相的颗粒直径更小、展开距离更短，分离度和灵敏度更高、重现性更佳。与高效液相色谱法（HPLC）、分光光度法、滴定法相比，HPTLC在成分分析方面的优势较大。HPTLC/TLC是近期开始使用的一种方法，可以用于简便、快速的分析大量植物材料并对其中的化学成分进行鉴定。另外，在有内参或外参的情况下，可以快速对比一系列样品的指纹图谱。
3.高效液相色谱（HPLC）鉴定方法
HPLC方法在植物化学分析、植物粗提物的鉴定和分离中起着重要的作用。将HPLC与PDA、MS、NMR等不同的光谱检测器联用，可以对植物进行二重鉴定。一方面,特定标记化合物可作为化学分类的依据。另一方面,将高效液相色谱指纹分析和模式识别分析结合可用于植物提取物的原产地鉴别。除了对生物材料进行鉴定外，HPLC法的另外一个优点是减少重复试验，通过联用NMR、MS、PDA35等方法，可通过一次性分析对多种成分进行鉴定。超高压液相色谱（UHPLC、UPLC）是通过使用抗压能力极强的固相颗粒，在施加高压的情况下实现快速洗脱，从而进一步增强柱效。
4.气相色谱（GC）分析
GC法主要用于含挥发油等挥发性成分的生物材料的鉴定，由于毛细管气相色谱柱的最大容量不断提高，气质联用（GC-MS）技术仍然是一种主要的分析方法。此外，顶空固相微萃取或水蒸气蒸馏萃取可用于从少量植物材料中收集挥发成分。而全二维GC和多维GC是通过串联不同的气相色谱仪器、色谱柱和检测器，再加上色谱峰的调制技术与多元数据分析，可以制作出更加精细的挥发物指纹图谱。同时，用气相色谱法测定细菌脂肪酸甲酯以鉴别细菌是一种常用的方法。
5.光谱分析法：核磁共振分析法（NMR）、质谱法（MS）、近红外光谱（NIR）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）
许多联用光谱技术被广泛用于NPs的鉴定和化学表征。例如：一种基于1H-NMR光谱的代谢谱分析方法被用于党参品种的鉴定。植物材料(新鲜或干燥)可以不经过预先提取就用于直接NIR分析。然而，需要注意的是，在使用红外光谱 鉴定方法时，必须考虑到植物材料的形态特征带来的影响。利用FTIR光谱技术可以快速、非侵入性评估食源性细菌的膜成分以及由于环境和其他应激因素引起的代谢变化。而利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）在短时间内对培养板上培养的菌落进行分析，极大的改进了微生物的原位鉴定方法。
二、提取方法
从植物材料中分离纯化NPs的第一步是萃取过程，萃取的效率一般取决于萃取物和溶剂的极性和稳定性，萃取溶剂的毒性、挥发性以及粘度和纯度。此外，最重要的是，有时在萃取过程中由于溶剂和萃取物发生反应，会导致新的产物出现。植物材料的处理一般是先进行阴干、粉碎，然后利用单一或混合溶剂在室温(25-30℃)提取24小时，滤纸过滤后留取滤液。然后，使用相同的溶剂再次对残渣进行提取，将两次滤液合并后在低压、45℃条件下浓缩成粗提物。植物材料的提取效率随着溶剂的不同而变化，而且，由于一些次生代谢物通常存在于细胞内，因此在提取前对植物原料进行充分研磨、破坏组织和细胞的完整性可以增加提取效率。实验室常用的NPs提取方法主要有以下几种：
1.经典的溶剂提取法
这是最常见的提取方法。方法包括浸渍法、渗滤法、索氏提取法、超声辅助提取法和涡轮萃取法。浸渍法主要是用溶剂浸泡植物材料，然后搅拌均匀，这一方法的优点是提取过程比较温和，缺点是溶剂使用量大、提取时间长、收率低。相比而言，渗滤法的收率较高，主要是将预浸过的植物材料放在容器中，通过底部的阀门对萃取物进行收集，并从顶部添加新鲜的溶剂。索氏提取法是一种很常用的提取方法，因为对溶剂的消耗较少，然而，热不稳定的成分在萃取过程中可能被降解。对于液体样品，用有机溶剂或非均相溶剂混合物在分离漏斗或索氏装置进行萃取即可。
2.超声辅助提取（UAE）
这一方法主要是将植物材料放入玻璃容器中，用萃取溶剂浸泡后放入超声波浴中，采用机械应力法进行提取。这种方法的萃取时间较短、萃取率较高，因此在实验室中的应用也比较广泛。
3.微波辅助提取（MAE）
其原理是样品及溶剂中的偶极分子在高频微波能的作用下，产生偶极涡流和高频率摩擦，从而在短时间内产生大量的热量。偶极分子旋转导致的弱氢键破裂、离子迁移等加速了溶剂分子对样品的渗透，将被萃取成分快速溶剂化，使萃取时间显著缩短。
4.超临界萃取（SPF）
这一方法主要采用对环境危害较小的萃取介质取代有机溶剂进行萃取。较为常用的介质是超临界二氧化碳。
5.固相萃取（SPE）
固相萃取法的萃取剂是固体，其原理是样品中欲测组分与杂质 在固相萃取剂上作用力强弱不同，从而对其进行分离。固相萃取剂一般是C18或C8柱、反相材料、离子交换树脂等填料。SPE法一般有三种萃取思路：一种是使液体样品中的被测物质保留在柱上，再选用适当强度的溶剂冲去杂质，最后用少量溶剂迅速洗脱被测物质；第二种是使干扰杂质吸附在柱上，而让被测物质流出。第三种是使杂质和被测物质同时吸附在柱上，再使用合适的溶剂选择性地洗脱被测物质，以达到分离的目的。近年来，分子印迹聚合物的问世为固相萃取技术带来了新的生机，无论是离子液体处理的二氧化硅颗粒，还是丙烯酰胺和乙二醇二甲基丙烯酸酯与各自的模板化合物的共聚物，都被用作固相萃取。在第一个洗脱步骤中，杂质从固相萃取柱中去除，而与固相结合的目标化合物则在浓缩溶液中获得，通常用甲醇等有机溶剂洗脱。
三、基于色谱技术的分离方法
许多色谱技术被用来对NPs进行进一步的分离和最后的纯化，较大的样品容量和相对较低的成本使得低压液相色谱法(LPLC)、真空液相色谱法(VLC)或闪蒸色谱法(FC)成为粗提物分离的常用方法。在极少数情况下，甚至可以通过这些单一的分离步骤得到纯化合物。但大多数情况下，还是需要在色谱分离的基础上进行进一步的处理，以获取较为纯净的化合物。
1.柱色谱技术
这一技术与传统的柱层析法非常相似，不同之处在于柱色谱是通过向溶剂施加正压以加快流动的，这使得大多数分色可以在20分钟内完成。现代的闪速色谱系统以预包装的塑料墨盒的形式出售，溶剂通过墨盒泵入，系统可以与自动检测器和收集器相连接。而梯度泵的引入使分离速度加快，溶剂用量减少。闪速色谱系统可以在不经离心、过滤等步骤的情况下，对培养液或破碎细胞的浆液进行分离。磷纤维素色谱法则是利用许多DNA结合蛋白对磷纤维素的结合亲和力较高的特性，而对蛋白进行分离的。
2.平面色谱法
平面色谱法是一种将固定相铺在光滑表面上，如玻璃、塑料、金属薄膜上形成薄层，或用纸作为载体进行色谱分离的方法。由于样品混合物中不同的化合物与固定相和流动相的相互作用的强度不同，它们的移动距离也不同。在纸色谱法中，把一小点或一行样品溶液放在色谱纸上，这张纸被放在一个装一定高度的流动相的罐子里封起来，当溶剂通过纸张上升时，它与样品混合物相遇，样品混合物开始与溶剂一起沿纸张上升。纸色谱的纸张通常由纤维素制成，它是一种极性材料，如果混合物中的化合物是非极性的，它们移动的距离就更远，其他极性物质与纤维素纸结合得更快，因此移动较慢。
3.置换色谱法
置换色谱是指样品注入色谱柱后，用一种与固定相作用力极强的置换剂通入色谱柱，去替代结合在固定相表面的溶质分子，在置换剂的推动下，样品中各组分按作用力强弱的次序流出色谱柱，形成一系列前后相邻的谱带。置换色谱法和洗脱色谱法有明显的区别。在洗脱模式下，目标成分常常出现在狭窄的高斯峰列中，只有通过梯度洗脱和降低柱压才能实现峰的基线分离。置换色谱法的优点在于其组分被分解为纯物质的连续区域，而不是“峰”，使纯化后的组分以明显较高的浓度被回收。
4.液相色谱
LC是一种流动相为液体的分离技术。目前最常用的是HPLC技术。在HPLC方法中，样品被高压液体(流动相)压入柱中，柱中填充由不规则或球形颗粒、多孔膜组成的固定相，按照流动相和固定相的极性不同，HPLC主要分为两种，一种是固定相极性大于流动相，被称为正相色谱；一种是流动相极性大于固定相，被称为反相色谱。一般来说，反相色谱较为常用。而另外一种液相色谱——亲和层析，它常用于生物化学中与标签结合的蛋白质的纯化，这些融合蛋白常常被连接一些特定的标签，如组氨酸标签（His-tags）、生物素或抗原，标签可以与固定相很好的结合。经过纯化后，将标签去除就可以得到纯蛋白。固定化金属离子亲和层析是一种分离纯化带有His-tag蛋白质的方法，它可以使蛋白质通过标签与金属离子螯合作用牢固地吸附在固定相上，而其他杂质蛋白由于不带有上述标签则不能与金属离子螯合，随着流动相流出，最后，再用特定的洗脱液把所需要的目的蛋白在层析仪上洗脱下来。此外，超临界流体色谱是一种分离技术，其中流动相是高于其临界温度和压力的流体。
5.其他分离技术
离子交换色谱法(IEC)使用离子交换机制，使用带电荷的固定相来分离带电荷的化合物，包括阴离子、阳离子、氨基酸、多肽和蛋白质。在传统的IEC方法中，固定相是一种离子交换树脂，它携带带电的官能团，这些官能团与化合物的带电官能团相互作用以使其保留。离子交换色谱法常用来纯化蛋白质。
凝胶过滤层析（SEC）也被称为分子排阻色谱或分子筛，它根据分子的大小(或者更准确地说是根据它们的流体动力学直径或流体动力学体积)来分离分子。较小的分子能够进入介质的孔隙，从而被截留在固定相中，化合物在色谱柱中平均停留时间取决于其分子的有效大小。然而，分子大于平均孔径的则被排除在外，顺着流动相流出。SEC是一种低分辨率的色谱技术，因此常常被保留到净化的最后一个“抛光”步骤。SEC还可以用来测定纯化蛋白的三级结构和四级结构。
反相色谱法是一种用于液相色谱的洗脱方法，其中流动相的极性明显大于固定相。
二维色谱法是指在某些情况下，给定色谱柱内的化学物质不足以分离某些分析物时，可以将一系列未完成分离的峰导入第二个色谱柱，由于这种新的固体载体上的保留机制不同于第一次分离，因此可以用于对一维色谱法分离难以分离的化合物进行二次分析。
热解气相/质谱联用技术(GC/MS)是一种化学分析方法，将样品在热解器（600-1000℃）中进行加热分解成小分子碎片，然后用GC进行分离，再用MS进行检测。由于对样品进行了预先分解，因此热解气相色谱图通常比较复杂，这些数据既可以作为指纹来鉴定材料，也可以作为GC/MS数据来识别单个碎片以获得结构信息。有时为了增加极性碎片的挥发性，可以在热解前向样品中加入不同的甲基化试剂。除了使用专用热解器，热解GC的固体和液体样品可以直接在可编程温度汽化器(PTV)中进行处理，它可以提供快速加热(高达30℃/s)和600-650℃的最高温度。
快速蛋白质液相层析是一类方法，包括几种用于纯化蛋白质的色谱技术。其中，FPLC技术通常用于制备大规模的纯化产品。
逆流色谱法（CCC）是一种液-液色谱法，其固定相和流动相都是液体，这种仪器的柱材料为空的聚四氟乙烯管或玻璃管，选用不相混溶的两相溶剂系统作为固定相和流动相，其中固定相依靠重力或离心力保留在柱内，另一相作为流动相。这种方法包括高速逆流色谱(HSCCC)和高性能逆流色谱(HPCCC)。HPCCC是目前最先进、性能最好的仪器。
手性 色谱法主要用于立体异构体的分离，是通过引入手性环境使对映异构体间呈现物理特征的差异，从而达到光学异构体拆分的目的。要实现手性识别，手性化合物分子与手性固定相之间至少存在三种相互作用。这种相互作用包括氢键、偶级-偶级作用、π-π作用、静电作用、疏水作用或空间作用。
最后，Alamgir Ahmad Dar博士表示，从分离、纯化到结构的鉴定，基于NPs的药物研发无疑是一个耗时且具有挑战性的过程，需要更多的耐心来鉴别、优化先导化合物。纵观历史，NPs为药物研发提供了丰富的化合物来源。从植物、海洋植物和微生物中分离出来的一些NPs可以作为苗头化合物，通过对苗头化合物的官能团进行分子修饰得到新化合物，或者以苗头化合物为模板半合成新化合物，都是获取活性更强、副作用更少的先导化合物的重要途径。目前来源于NPs、并在临床中广泛使用的药物包括洛伐他汀、环孢素-α、阿霉素、他克莫司或FK506(免疫抑制剂)、红霉素、紫杉醇、喜树碱等等。
近年来，由于各种色谱、检测器联用技术的发展，使提取物的分析变得迅速，这些技术正在成为现代药物发现的主要平台。然而，目前对NPs多样性的系统研究和认识仍然不足，未来还需要在细胞层面和生化方面进行更加深入的探究，为发现更多具有研究价值的NPs提供方向和指导。如果曾经的药物研发史对今后的研究有任何指导意义的话，毫无疑问，那就是还有更多的NPs有待我们发现和发掘。
作者：识林-柠® 版权所有，未经许可不得转载。如需使用请联系 admin@shilinx.com 。
参考资料
