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从新冠候选疫苗 BNT162b 看 mRNA 疫苗
出自识林
从新冠候选疫苗 BNT162b 看 mRNA 疫苗
2020-11-03
欧盟药品管理局（EMA）于10月6日宣布，基于BNT162b2的非临床和早期临床初步结果，对辉瑞/Biontech的候选新冠疫苗展开滚动审评，这是EMA第2个开展滚动审评的新冠疫苗，上一个是阿斯利康与牛津大学合作开发的AZD1222疫苗。CHMP已开始审评关于疫苗的非临床实验数据1。辉瑞之前曾表示最早10月份就能取得该疫苗后期试验结果，但现在看来这一时间会有所延迟，而该疫苗的首个I期试验今年4月下旬才开始进行。正如该项目的名称“光速计划（Project Lightspeed）”一样，候选疫苗在极短的时间内被开发。这当然是新冠大流行背景下的产物，但也同时体现了mRNA这种新型疫苗平台的“通用性”特点，可快速完成新品种疫苗开发。目前世界上还没有一种mRNA疫苗被批准上市。
mRNA疫苗的特点
mRNA疫苗技术新颖、特点鲜明。mRNA疫苗是使用线性DNA模板和T7、T3或Sp6 RNA聚合酶这种体外无细胞转录过程批量生产的。这使生产变得简单快速，并有可能在比传统疫苗方法更短的时间内产出更多剂量的疫苗，这在传染病大流行中启动最有效的响应至关重要。现代预防疫苗的安全性要求极其严格，因为疫苗是给健康的人接种的。由于mRNA疫苗在无细胞条件下生产且制造时间短，这使得引入污染微生物的机会很少。与减毒活疫苗相比，mRNA疫苗不具有与感染相关的风险，可用于无法注射活病毒的人（如孕妇和免疫功能低下者）。与灭活疫苗和重组蛋白疫苗相比，mRNA疫苗可激活强烈的细胞免疫。与DNA疫苗相比，其在胞浆中表达蛋白，不需穿过核膜，也不存在插入突变的潜在风险。基于上述原因，mRNA疫苗被认为是一种相对安全的疫苗形式。然而mRNA疫苗是一项新技术，尚未有一款批准上市的mRNA疫苗，目前也不清楚大规模生产和长期储存稳定性（需要冷冻储存）会遇到哪些问题。
mRNA疫苗技术的发展
1990年，首次报道mRNA注射到小鼠体内并检测到蛋白质产生（图1），这形成了mRNA疗法的雏形。然而早期的研究结果并没有导致对mRNA疗法开发的大量投入。相反，领域内寻求基于DNA和基于蛋白质的治疗方法。这主要是由于mRNA的不稳定性、高先天免疫原性和较低的体内递送效率决定的。
近年来，各种mRNA治疗和递送技术被开发出来，打破mRNA疫苗的技术壁垒。体外制备mRNA的基本结构包括了5’帽、3’Poly(A)尾、编码目的蛋白的开放阅读框（ORF）以及非翻译区域（5’UTR和3’UTR），优化策略见表1。
目前为止，主要有2种基本的mRNA疫苗递送方式，一是在体外将mRNA装载入树突状细胞（DC），然后将转染的DC细胞输回体内。另外一种是直接注射（借助或不借助载体），mRNA需进入细胞并从溶酶体逃逸，才能在胞浆中表达目的抗原。脂质递送系统通常由单层或多层磷脂双分子组成的球形囊泡，内含目的基因的水性核心；常用载体包括脂质体复合物（LP）、脂质体聚合物（LPR）、脂质体纳米粒（LNP）、阳离子纳米乳（CNE）。脂质材料一般有胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰胆碱（DSPC）、鱼精蛋白、二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPE-PEG）等4。表1总结了mRNA递送方式和优化mRNA药理学性质的策略。Biontech的新冠疫苗使用的递送载体是LNP（CureVac和Moderna也是，见表3），从NCT04368728的实验方案可见安慰剂是生理盐水，这也是LNP的一个特点，若无RNA核则不能形成稳定结构，因此无法使用空载体作为对照。
表1 优化mRNA药理学性质的策略和mRNA递送方式5
BNT162项目的技术路线及现状
目前在疫苗中研究的RNA主要有两种:非复制mRNA和病毒来源的自放大RNA（self-amplifying RNA，saRNA），传统的mRNA疫苗编码目的抗原，而saRNA也编码一种病毒复制机制，使细胞内RNA扩增并增加蛋白表达，从而最小化RNA所需剂量。
大多数研发冠状病毒疫苗的公司只有一种候选疫苗，但辉瑞和Biontech并非如此。从一开始，BNT162项目就包含了四种基于mRNA技术的COVID-19候选疫苗（BNT162a1、BNT162b1、BNT162b2、BNT162c2）。包括2种核苷修饰mRNA，1种非修饰mRNA和1种saRNA。其中b1和b2都是核苷修饰的mRNA，通过LNP（lipid nanoparticles）递送，b1编码受体结合域，b2编码S蛋白全长。辉瑞和Biontech最初报告了b1的早期临床研究的积极结果，而最终选择了b2进入关键的2/3期临床试验。原因是相同剂量下b2比b1的安全性结果更好，尤其是在老年受试者上。LNP的组成、处方成分或疫苗RNA的序列选择都可能影响副作用。由于两种疫苗具有相同的核苷修饰RNA平台、RNA生产和纯化过程以及LNP的处方，b2的反应原性低于b1的原因尚不确定。2种疫苗编码RNA占总长RNA的比例不同，相同给药剂量下b1的RNA分子数约是b2的5倍。RNA的核苷酸组成影响其免疫刺激活性和反应原性，这可能是2种疫苗差异的一个解释6。
从BNT162项目的临床设计可以看出，最先在德国进行的I/II期试验（NCT04380701/BNT162-01）研究了4种候选疫苗（a1、b1、b2、c2），接下来进行的全球多中心I/II/III期试验（NCT04368728/C4591001）则只评价b1和b2，在辉瑞公布的临床方案中写道“由于德国进行的BNT162-01试验数据，不再对a1和c2进行研究”7，目前该项目发表的研究结果并没有提及这2种疫苗，无法得知这2种疫苗的有效性和安全性。另外，一个有趣的现象是，申办者又开展了第5种疫苗BNT162b3的I/II期临床研究，也有人认为这是在部署新冠疫苗的2.0计划，因为最先上市的疫苗并非一定最好，申办者可能希望能长期占据新冠疫苗市场有利地位。
mRNA疫苗的监管角度
FDA对基因治疗的定义如下:基因治疗是一种通过改变人的基因来治疗或治愈疾病的技术，可以拷贝健康基因替代致病基因、使功能不正常的致病基因失去活性或者将一种新的或修饰过的基因导入体内以帮助治疗疾病。由于RNA不会改变活细胞的遗传物质，可以预见，在美国它的管理不会被归类为基因疗法。
对于欧盟，根据Directives 2009/120/EC，“基因治疗产品是指具有以下特征的生物药用产品：“(a)含有用于给人类使用的重组核酸活性物质，以调节、修复、替换、添加或删除遗传序列；(b)其治疗、预防或诊断效果直接与其所含的重组核酸序列或该序列的遗传表达产物有关。基因治疗药物产品不应包括预防传染病的疫苗”。体内给药的mRNA药物产品可能被视为一种附加的重组核酸，符合欧盟对基因治疗产品的定义。预防传染病的疫苗不属于基因治疗，也不属于先进治疗产品（ATMP），由人用药品委员会（CHMP）审评。而满足ATMP条件的mRNA疫苗则由先进疗法委员会（CAT）审评。值得注意的是，在CAT给出的ATMP分类的科学建议网页中，有1个转染RNA的治疗性DC疫苗被分类为体细胞治疗产品，而不是基因治疗产品，理由是其认为在将细胞回输体内时RNA已经降解3,8。
表2. CAT的ATMP分类的科学建议举例9
CDE于2020年08月14日发布新型冠状病毒预防用mRNA疫苗药学研究技术指导原则（试行），用于指导应急状态下mRNA疫苗研制。非临床方面，产品安全性风险可能来源于mRNA、脂质递送系统两个方面，非临床研究中需关注脂质的毒性及在人体内诱导自身反应性抗体等，对于包含的新型脂质材料，需单独开展全面的安全性研究，不仅考察其一般毒性，还需关注其遗传毒性、生殖毒性等4。而FDA和EMA目前对mRNA疫苗产品都没有专门的指南，不过为基因疗法制定的指南可能对RNA疫苗的监管框架的建立也很有价值。另外，治疗性mRNA肿瘤疫苗也应参考FDA 2011年发布的《治疗性癌症疫苗的临床考虑行业指南》。
mRNA疫苗临床研究现状
在ClinicalTrials 使用“mRNA Vaccine”为关键词检索并筛选，整理出相关临床研究（表3）10。可以看出mRNA疫苗主要应用于肿瘤的治疗和感染性疾病的预防。肿瘤治疗性疫苗发展较早，大多数使用DC递送方式。近些年感染类疾病的mRNA疫苗研究明显增加，目前的递送方式以LNP为主。
表3 ClinicalTrial检索到的mRNA疫苗临床试验
参考资料
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2. Hajj, K., Whitehead, K. Tools for translation: non-viral materials for therapeutic mRNA delivery. Nat Rev Mater 2, 17056 (2017). url
3. Sahin, U., Karikó, K. & Türeci, Ö. mRNA-based therapeutics — developing a new class of drugs. Nat Rev Drug Discov 13, 759–780 (2014). url
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5. Pardi, N., Hogan, M., Porter, F. et al. mRNA vaccines — a new era in vaccinology. Nat Rev Drug Discov 17, 261–279 (2018). url
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7. PF-07302048 (BNT162 RNA-Based COVID-19 Vaccines) Protocol C4591001 url
8. Hinz T, Kallen K, Britten CM, Flamion B, Granzer U, Hoos A, Huber C, Khleif S, Kreiter S, Rammensee HG, Sahin U, Singh-Jasuja H, Türeci Ö, Kalinke U. The European Regulatory Environment of RNA-Based Vaccines. Methods Mol Biol. 2017;1499:203-222. doi: 10.1007/978-1-4939-6481-9_13. PMID: 27987152.
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