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出自识林

2015-12-01

关于手动积分的检查不合格项

在2014年，FDA对欧洲某实验室的检查中，483表格中有一个观察项这样表述：没有描述如何进行手动积分的操作规程（No procedure exists describing how to perform manual integration）。在2007年8月，FDA给Leiner Health Products公司的警告信中，有一条缺陷项这样表述：检查员记录了很多“数据捏造(manipulation of data)，却没有解释捏造原因”。这个捏造包括：改变色谱积分参数、重新标记峰，这样之前本应该积分的峰就不再积分，不计入杂质的计算。这说明了FDA是接受手动积分的，但应该有操作规程控制手动积分的条件、权限、注意事项等，不能背离科学地通过手动积分使检验结果合格。

备注：在FDA的现场检查中，例如发现预进样、重复检验的情况，检查员的观点是：如果企业证明是科学的、必要的，就应该写入操作规程。这也意味着，需要经过充分验证、科学评估。

手动积分的担忧

色谱积分的担忧

手动积分的用处

理想条件下，在通过系统适用性试验后，标准品、样品的色谱应一直以相同的方法进行积分。但是实际情况并非如此，尤其是接近定量限、检测限的情况下，有些峰自动积不上，需要手动积分。手动积分虽然会受主观因素的影响，在科学分析色谱结果时也是需要的。举两个例子说明：

例1，当出现异常峰，分离度不好的峰时，可以手动强制分割。
例2，研发阶段，API、稳定性样品的纯度、降解产物的检验方法色谱运行条件相同，但应考虑到检测分析的重点不同，可能需要不同的积分参数。在这种情况下，最好建立不同的分析方法、程序。

关于手动积分的指南

关于手动积分，并没有指南给出明确的定义。笔者只查到有两篇生物样本分析的方法验证指南规定了再积分（Reintegration）的注意事项。

FDA的2001年定稿指南 Bioanalytical Method Validation，及相应的2013年草案指南也有类似的要求。 生物样本分析的方法验证2013草案指南，第III.C节“样本数据再积分”规定：SOP应该确定再积分的标准，和怎样进行再积分；应清楚描述、并记录再积分的理由；应报告原始和再积分数据。第VII.D节还规定：再积分数据应有管理人员授权再积分。

EMA的2011年指南 Guideline on bioanalytical method validation，第5.5节规定：应该有SOP描述色谱的积分和再积分。应在分析报告中讨论偏离这个SOP的任何偏差。应该记录色谱积分、再积分的积分参数、初始积分数据、最终积分数据，并在要求时立即可得。

没有公认的手动积分定义

目前没有关于手动积分的公认的定义，Hill的一篇文章，讨论了手动再积分的范围和术语，并总结认为，建立一致的定义是有必要的。如果没有手动积分的定义，企业怎么建立积分的SOP呢？

在2015年11月，美国费城的ISPE年会上，企业人员Bob McDowall和Mark Newton建议区分手动干预（Manual Intervention），和手动积分（Manual Integration）,并提出：
手动干预 ：没有手动改变基线，例如：1）对峰重命名，或调整积分窗口；2）改变积分参数；
手动积分 ：分析员手动重新划基线。

举两个例子说明：
例3，在色谱峰的保留时间不在预期的时间窗口内，需要手动干预时间窗口，而峰面积不会改变；需要调查保留时间偏离的原因。可能FDA会把这个干预也归为手动积分；但是Bob认为不必归类为手动积分。所以希望监管机构给出明确定义的指南。
例4，有IPEM学员单位提议：手动干预、手动积分这两种方式在有些情况下可替代使用的。峰无法识别（或不能正确识别）时可能通过手动积分（重画基线）或调整积分参数解决；峰积分不好时可通过手动积分（重画基线）或调整积分参数解决。

手动积分使用的注意事项

通常，在得到自动积分色谱图后，分析保留时间、峰型是否如预期，峰是否被正确识别，基线是否满足要求，或者其它标准。只有在色谱图不可接受时，才可考虑是否可以进行手动积分，或者进行实验室调查。

有两种情况，是禁止进行手动积分的：

• 在自动积分后，对称的峰有可接受的基线；
  
• 增强峰、或削减峰的目的是为了满足系统适用性接受标准，或满足放行质量标准。

所以，企业应建立科学、合理、透明的自动积分操作规程，并满足数据可靠性的要求。在SOP之外进行的手动积分可能被视为数据造假。

色谱软件选型、权限设置和结果显示

满足合规要求的色谱软件（例如Waters和Angilent的软件），能够分别设置不同权限，例如普通化验员不具备进行手动积分的权限，需要主管进行操作，有些软件则不具备这些功能；即使是同一个品牌的软件，也有不同版本；即使软件有这个功能，企业也不一定启用。 （企业已经在用的老系统legacy system，无法通过软件权限控制的，只能通过SOP进行控制，同时建议基于风险逐步替换为新的完全符合GMP的系统）

有两个信息是否显示，对色谱数据透明度非常重要：方法名称和数据版本。 如果企业不使用手动积分（重画基线），而采用修改参数的方式，则每修改一次，是不同的方法（规范的管理程序会要求更改方法名称保存，否则就只能到audit trial才能查出来这个方法已经被修改了），而打印的色谱图可以选择是否显示方法； 每处理一次数据，会形成一个数据版本，同样的，打印的色谱图可以选择是否显示数据版本。一个完全透明的结果显示，会在打印的色谱图上显示“方法名称+数据版本” （同时要求修改参数则改变方法名称，不需要QA或检查员仔细检查audit trial才能发现修改痕迹）。

QA产品放行时对手动积分的判断原则

“手动积分应以能获得更准确的检测结果，并且不增加产品质量风险为原则，同时及时记录相关的科学依据。”

以文章第2小节“手动积分的担忧”中的色谱积分为例，图中哪种操作是放大质量风险呢？答案是视具体情况而定。
例如如果左边这个峰是主物质的峰，这个检测是含量（或纯度）检测，则“ 红线（左），削减峰的积分方式会造成峰面积的偏小”实际上控制得更严，如果我们知道在这个位置可能存在一个其它杂质，则这也许是一种适当的手动积分处理；反过来，如果左边这个峰不是主物质峰，它是一个杂质峰，其意义正好相反。 如果这两个峰一个是主物质峰，另外一个是杂质峰；而另外一种情况，这两个峰是这个药里面的两个组分，分别有不同的含量标准；同一个手动积分操作的意义，对产品质量风险的影响是完全不同的。

这里有太多可能性，在这里不详细描述每一种情况了，但其原则（基于科学，力求准确，不增加质量风险）是明确不变的。

感谢IPEM2007级学员闭欢欢及单位同事邓玉庄、林宾、黄仲仪对本文的贡献。

作者：识林-榕

参考文献：
H.M. Hill, D. Bakes, and I. Love, Bioanalysis 6(9), 1171–1174 (2014)
Bob McDowall in LC-GC Europe，Where can I draw the line (June 2015)