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出自识林

2019-06-27

美国药典（USP）<1071>《无菌短效期产品的快速微生物检测：一种基于风险的方法》将于年底生效，一些读者对于这方面的内容多有关注，识林对于该章节内容翻译如下，供读者参考，具体内容还请查阅 USP <1071>原文。

<1071>无菌短效期产品的快速微生物检测：一种基于风险的方法

介绍

人们普遍认为，目前基于生长的无菌检测，繁殖期至少为14天（参见无菌检测<71>），不适用于短效期产品或立即使用的产品，这些产品通常在完成检测之前就注入患者体内（1）。这些短效期产品包括配药无菌制剂（CSPs）、正电子发射断层扫描（PET）产品以及细胞和基因治疗产品，这些产品需要新一代基于风险的方法，包括快速微生物检测。关于无菌检测以外的有助于无菌保证的因素的一般性讨论，参见无菌保证<1211>。应当注意，与其它检测方法一样，发生争议时的裁判检测是<71>。

如果执行微生物检测，通过在产品使用前完成检测微生物污染的测试能最好地保护患者安全。

快速微生物检测（RMT）应基于风险，因此利益攸关者可以选择适合其预期用途的首选技术，并平衡用户需求标准（URS），包括出结果时间、特异性、检测限（LOD）、样本量和产品属性。例如，许多放射性药物，由于放射性示踪剂的半衰期短，从实时微生物检测中受益最多，而CSP和细胞治疗产品，由于其失效期短，隔夜检测或至少一个在48小时内完成的检测比较好。

该通用信息章节讨论了生产/制备和检测短效期产品的需求及其URS，并简要讨论了短效期无菌产品（以下称为“短效期产品”）放行的基于风险的快速微生物检测方法的一些适用方法。

用于无菌短效期产品放行的快速微生物检测的用户需求标准

用于短效期产品放行的快速微生物检测的合适技术的选择应该是基于风险的决定。不同技术的URS（2）包括：

• 尽可能短的出结果时间，理想情况下是实时或少于24小时，最好是在产品给药之前出结果
• 能检出，最好能检出检测样品中少于100个菌落形成单位（cfu）
• 能够检测产品中的各种微生物
• 样品数量，即，待测样品的最低数量和每个待测容器的数量，不能消耗很大一部分可用产品;在可行的情况下，生产商应考虑工艺设计中的含量测定要求
• 无菌检测物料处理，即以减少检测过程中的疏忽污染的密封系统。
• 来自多个供应商的仪器和试剂的可用性
• 参照标准品、阴性和阳性对照的可用性，使用除菌落形成单位之外的信号的适用技术
• 易于使用/简单的检测和数据解释
• 假阳性结果率和假阴性结果率低
• 针对每种特定产品的方法适用性检测策略
• 以下方面带来的患者安全性的改善：
  • 在给药前完成检测
  • 提供渐进式监测和发现无菌检测失败报告的检测
• 能够识别检测到的微生物，这些微生物对于临床医生用药和确定其来源的调查可能是有用的
• 检测中使用的设备和试剂的稳健性和可靠性
• 适用于人工和自动方法的样品制备

基于风险的微生物监测和放行检测的概念

对RMT的URS审查显示，某些基于风险的决策需要特别根据出结果时间、LOD、样本量和检测到的微生物范围来做出，以允许在给药前使用这些检测。在当前药典无菌检测不合适的情况下，利益攸关者应对选择RMT进行风险评估。

益处可能包括，例如：

• 当产品使用太晚时，存在对患者存活的重大风险的情况下，使用RMT。临床文献中一个突出的例子是血流感染，即快速进展性感染，死亡率高达40％，并且抗生素给药每延迟一天导致死亡率增加10％（3）。在这些情况下，通过在给药之前完成微生物检测，明显促进患者安全。

• 使用具有连续读数的基于生长信息的RMT应用于风险放行的“到目前为止阴性（negative to date）”，因为可以提前检测到快速生长的微生物，并且如果检测到不合格，则临床医生能够更快地干预患者。当检测到受污染的产品时，实验室主管可以通知临床医生治疗患者，并且可以启动血管内液体复苏和抗生素治疗以避免脓毒性休克。因此，与在培养期结束时的单次读数相比，逐步监测并自动报告任何不合格的无菌检测将具有额外优势。

• LOD高于1 cfu的基于非生长信息的RMT的使用，这种RMT通过微生物培养基中的生长放大但出结果非常快。在短效期产品给药之前实时检测污染的能力可能被认为比检测产品中单个菌落形成单位更为重要。当考虑患者的风险时，RMT的选择应考虑检测灵敏度与检测时间的关系。测定应当对检测低浓度污染物的存在是相当敏感的，并且应该在产品给药之前出结果的时间框架内这样做。

• 基于非生长信息的RMT方法的其它优点还可能包括不被检测样品中的抗生素影响以及培养基阴性感染因子的检测。一些DNA靶向抗生素（例如，多粘菌素B和杆菌肽）已被证明可抑制PCR扩增，而抗生素（如青霉素G、氯霉素、两性霉素和萘啶酮酸）不会影响反应的分辨潜力。这对于生产可注射抗生素溶液的无菌配药房来说是最重要的。方法适用性应确定检测样品中的抗生素是否会影响测定。

此外，RMT或其它快速微生物方法（RMM）可在最终产品放行无菌检测之前用作中间过程控制，以提供关于微生物控制有效性以及对污染物的早期发现（能够调查和尽早重新开始生产）或产品可能无菌的可能性的更快信息。

对于风险评估，可能忽视的一个考虑因素是基于注射或输注产品体积以及给药部位对患者的相对风险。体积越大，侵入性越大，患者血流感染的风险就越大。风险范围从小体积的皮内注射到大体积的静脉输注（见表1）。

表1.按给药途径的代表性容量和相对风险水平

确定用于无菌短效期产品放行的基于风险的快速微生物检测所需的关键操作参数

表2列出了适用于RMT的候选技术的估计操作参数，即LOD、出结果时间和样本量。

表2.候选快速微生物技术的操作参数

^a对于这些方法，信号为基因组单位。

<71>不适合进行产品放行检测的情况

样本量考虑因素

根据技术的样品处理能力或保存急需产品的需要，可能需要降低检测的样本量。

每种培养基所用产品的最小量和待测单位相对于批量的最小量见<71>表2和表3。普遍认为，对于大批量药品，检测的单位数量不是基于统计学的，并且在单个产品批次中检测低污染水平的能力降低。然而，由于许多短效期产品的批量较小，这种限制将会降低，因为相对于批量，检测产品的比例将增加。

这种传统的取样计划不适用于细胞治疗产品。例如，如果制备了10个单独的60-mL静脉注射袋的细胞，那么需要从4个袋子每个袋中取出20mL。采用这种取样方案，批次的40%将被消耗用于无菌检测，这不仅代表了巨大的经济损失，而且更重要的是，治疗性产品的巨大损失可能会妨碍给予足够的剂量治疗患者。相比之下，如果40个单独的1毫升西林瓶用于40,000瓶注射药品批次的无菌检测，则样品仅占该批次的0.1％。

减少样品量和检测的单元数将降低无菌检测的灵敏度。表3和表4说明了药品和CSP检测的相对不敏感性。

表3.假设药品污染率增加，20单位无菌检测通过的概率

由以下公式计算（4）：

p = (1 - p )20 = q20

p =批次中受污染容器的比例

q=批次中未受污染的容器的比例

表4.假设CSP的污染率增加，6单位无菌检测通过的概率

在其它药典中已提出了替代取样计划。欧洲药典9.0章节2.6.27《基于细胞的制剂的微生物学检查》中给出了对于批量小于40单位的细胞治疗产品无菌检测的推荐方法。

体积在10到1000毫升之间的细胞制剂的污染检测样本量为总体积的1％；对于体积在1到10毫升之间的细胞制剂，取样量为0.1mL；对于小于1 mL的细胞制剂，不检测。正如21 CFR 610.12（无菌）中所建议的那样，使用快速方法的中间过程检测可以在完全合理的情况下用于代替最终产品检测。

以与细胞治疗制剂类似的方式，PET放射性药品的取样量和取样计划也必须适应有限数量的西林瓶（通常为一个）和一批产品的体积（通常少于15毫升）。如果批次由单一容器组成，则无菌检测样品量至少为总批量的1％。例如，如果一个批次由一个装有15毫升药的西林瓶组成，使用至少0.15mL用于无菌检测。如果批次由一个以上的容器组成，则使用单个容器中的体积至少占总批量体积的1％。如果一个批次由每个含有25mL药品的3个西林瓶组成，从1个西林瓶中使用至少0.75毫升用于无菌检测。

检测限

在从具有一个或多个菌落形成单位的细胞悬液制备接种物的限度内，基于生长的无菌检测可以被证明具有以下特性：基于泊松分布，理论LOD最少为1-3 cfu。使用所有技术设定单个活细胞的LOD对于任何无菌检测是不切实际的壁垒，特别是当信号不是通过培养富集扩增的菌落形成单位时。

检测多种微生物的能力

虽然所有的分析平台都应具备检测多种细菌、酵母和霉菌的能力，但是证明选择用于RMT的技术能够检测出与无菌检测失败，感染爆发，以及与CSP、放射性药物、细胞疗法或生产的药品相关的产品召回具有实际意义。如果风险分析后的技术能够证明通过对利益相关者群体独有的产品施用提高患者安全性，则尤其如此。

无菌短效期产品放行的快速微生物检测方法

基于与上文讨论(2)的适用于RMT的URS的匹配，建议的技术按字母顺序排列如下：

• 三磷酸腺苷（ATP）生物发光
• 流式细胞术
• 等温微量量热法
• 核酸扩增
• 呼吸
• 固相细胞计数

技术的概要性描述

对这些候选先进分析平台中的每一个技术单独简要讨论，并提供关键参考文献。概述参阅Moldenhauer（5）。

三磷酸腺苷生物发光

这是一种成熟的技术，可以从多个仪器制造商处获得发光计和试剂。来自活细胞的能量存储为ATP，并且当暴露于来自美国萤火虫的荧光素酶下时可测量到光。荧光素酶消耗的每个ATP分子产生1个光子的光。由发光计检测的结果通常以相对光单位（RLU）表示，并依赖于仪器、试剂和微生物。对于革兰氏阴性菌，不同微生物的ATP含量范围为2至4 x 10^-18 mol / cfu，革兰氏阳性菌为5至8 x 10^-18 mol / cfu，真菌为300至800 x 10^-18 mol / cfu（6）。鉴于测量的高信噪比和微生物培养基中的背景ATP，发酵液中微生物学相关的仪器检测限为5000RLU，相当于约10³cfu。

该LOD将检测出在培养基等分试样中微生物的存在水平低于培养基生长目检所需的微生物水平3-4个对数水平。对于无菌短效期产品放行的快速微生物检测，可以使用在液体培养基中达到阈值ATP水平的富集培养物，或者在用于形成微生物菌落的固体培养基上的膜滤器上的富集培养，培养时间为2-7天

流式细胞术

流式细胞术可被用于在24-48小时的富集培养步骤后检测荧光标记的活微生物细胞（7）。由荧光底物或活体染色剂组成的标记试剂被用于区分活细胞与死细胞和细胞碎片。虽然细菌非常小并且可能难以与细胞碎片区分，但它们可以通过大小、形状和荧光强度来区分。细胞活力表现为完整细胞膜保留由非特异性细胞酯酶产生的荧光色素的能力，或用核酸特异性活体染色标记细胞的能力。激光照射流体介质中的每个细胞，并通过双光电倍增管阵列检测发射的光。信号由鉴别软件数字化和解释。该技术的LOD可能>1 cfu，并且可能需要富集步骤。

等温微量量热法

等温微量量热计可以监测与微生物代谢活动和生长相关的密封瓶（系统）中的焓变。使用现有仪器，10⁴个活性微生物细胞可释放足够的热量进行检测，检测需要富集（2-7天出结果）。最近，其在药物微生物学中的应用已得到评估，尽管尚未确定其对无菌产品放行检测的具体应用（8）。

核酸扩增

实时定量聚合酶链反应（PCR）有可能通过使用通用引物和探针（称为“泛细菌”和“泛真菌”方法）进行36-48个扩增循环监测PCR的指数期，来估计目标DNA的初始量，目标DNA的初始量与检测样品中微生物细胞的数量成比例。与DNA不同，细胞RNA快速代谢转化，是活微生物的更好的指示剂。例如，大肠杆菌每个细胞含有2个DNA分子和2x10⁴16S rRNA分子（9）。该过程是通过逆转录酶将RNA转化为DNA（cDNA）的互补拷贝来实现的，并且可以通过定量（计数检测）或定性测定（无菌检测）实时分析cDNA。或者，对于基于DNA的PCR，使用叠氮溴化乙锭或叠氮溴化丙锭预处理的样品也可提供区分活的和死的微生物细胞的能力（10,11），或通过离心/洗涤步骤从检测样品中除去游离的微生物DNA并且分析细菌沉淀。

实际上，单个活细胞的LOD可能是一个不可逾越的挑战，特别是对于依赖DNA / RNA靶标和通用引物的检测。另一个挑战是不同微生物中不同量的基因组物质。

一般来说，样品中的LOD范围从10到1000个活细胞/mL，在一些报道的情况下，为10到100个活细胞/mL。最近有研究表明，不需要在微生物生长培养基中预孵育的情况下，PCR实际上可以在含有高达10⁶个哺乳动物细胞/mL的高浓度样品中检测出限度为10²-10³cfu / mL的微生物（12）。增加至少24-48小时基于生长的富集步骤，比较培养基富集前后的PCR结果，可为无菌检测提供切实可行的解决方案。或者，可采用浓缩方法富集样品并减少样品体积。正如最近一项对干细胞使用16S rRNA PCR无菌检测的研究的作者所指出的，其经证明的细菌灵敏度为10-100 cfu / ml，灵敏度为100 cfu / mL的检测方法适用于检测血液和细胞产品临床上显著的细菌污染（13）。

基于生长与基于核酸扩增的测定的直接比较是复杂的，基于核酸扩增的测定也检测到非活体微生物，并且量度的是微生物基因组拷贝数，而不是菌落形成单位。因此，基于核酸扩增的测定的LOD应根据每毫升的基因组当量来定义。

出于以下原因，用于无菌短效期产品放行的基于非生长的RMT（例如核酸扩增）可能具有额外的优势：

• 接近实时检测，检测将在短效期产品注入患者之前完成
• 检测培养阴性传染因子
• 如本章前面所述，受试样品中抗生素对检测的影响最小
• 由于靶向针对特定的微生物基因，因此与其它技术相比，检测对动物细胞裂解产生的背景（例如，颗粒、ATP）不太敏感。

呼吸

这一广泛类别包括传统的呼吸计、气态顶空分析仪到自动血液培养系统。好氧和厌氧肉汤配方可以在5天培养过程中恢复大部分造成血流感染的微生物。对于一些仪器，这包括如<71>所述在20°-25°和30°-35°温育。该技术已经成功地扩展到细胞治疗产品细胞的无菌检测，使用7天培养作为批放行的药典无菌检测的替代方法（14）。

其它仪器可用于检测和计数呼吸微生物。例如，可调谐二极管激光吸收光谱法（TDLAS）可测量培养基中含有生长微生物的密闭单位中的氧气（O₂）损耗或二氧化碳（CO₂）增加。该技术最初被开发用于监测封闭装置中的气体顶空成分，也可用于自动培养基灌装检查（8,15）。该系统具有气体校准标准，如果该系统用于无菌检测（例如，校准更高容量的容器），则需要进行微调。[注意 - 呼吸平台的所有系统都需要检测微生物生长和代谢活性，即通常需要2-7天才能获得结果。然而，如果可以逐步监测结果，以便在孵化期的早期发现无菌检测失败，那么如上文风险评估部分所解释的那样，这对于短效期产品是一个巨大的优势。]

固相细胞计数

有基于固相细胞仪结合荧光标记和固相激光扫描的仪器系统能快速计数可过滤液体中的活微生物（16）。通过在0.45微米聚酯膜上过滤收集微生物，并用背景和活力污渍处理。通过高速488 nM氩气激光在细胞计数器中扫描过滤器。基于大小、形状和荧光强度对多个光电倍增管进行处理以区分标记微生物和背景噪声，检测荧光。扫描显示为一个地图，用于识别荧光事件的位置，使用具有自动电动载物台的落射荧光显微镜验证这些荧光事件以定位各个事件。据称该系统可在2-3小时内检出个体活微生物。值得注意的是，大多数细胞治疗产品是不可过滤的，因此该技术可能与这些类型的产品不兼容。

方法适用性试验

基于生长的无菌检测的方法适用性要求见<7>。每种待检产品必须证明检测的适用性。对于直接接种或膜过滤方法，在微生物生长培养基中，在残留产物存在下，USP挑战微生物的回收水平低于100 cfu。对于来源于实验室培养基的菌落形成单位以外的信号（例如，核酸、ATP和活微生物细胞的荧光标记），检测实际样品的结果可能会给出与使用其它技术不同的结果。然而，方法适用性试验将确认分析物中的产品残留物不会抑制与快速方法产生的信号相关的酶促步骤。

术语

菌落形成单位（cfu）：能够在固体微生物培养基上生长的活的微生物，形成离散的、可见的菌落。

检出限（LOD）：代表可以常规检测的活微生物的最低信号。

患者安全：通过在给药前完成快速微生物检测来降低受污染产品接受者的发病率和死亡率。

正电子发射断层扫描（PET）：一种用于观察体内代谢过程的核医学功能成像技术，用于辅助诊断疾病。该系统检测出被引入体内的发射正电子的放射性核素（示踪剂）间接发射出的γ射线对。

基于风险的快速微生物检测：由利益攸关者在考虑LOD、样本量、特异性和出结果时间后选择的快速微生物检测，通过在短效期产品给药之前完成检测发现污染（如果有）来促进患者安全

特异性：能够检测多种不同的细菌、酵母菌和霉菌。

出结果时间：完成微生物检测并得出样品检测没有污染的结论的时间。

参考文献

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