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应对杂质挑战，USP治疗性多肽和寡核苷酸2022研讨会
出自识林
应对杂质挑战，USP治疗性多肽和寡核苷酸2022研讨会
2022-06-10
近日，美国药典委员会（USP）举办了治疗性多肽和寡核苷酸在线研讨会，聚焦于了解和应对杂质挑战方面取得的进展。
治疗性多肽和寡核苷酸是快速发展的产品类别，在各种治疗领域具有广泛的发展潜力。然而，多肽和寡核苷酸是复杂的分子，在开发、生产和质量控制 方面均面临科学和监管挑战。而新的挑战不断出现，需要利益相关者跟上多肽/寡核苷酸领域快速创新的步伐，包括：
此次USP研讨会通过专家分享和小组讨论，阐明了治疗性多肽和寡核苷酸的质量问题，以及为如何解决这些问题提供了建设性信息。IPQ（International Pharmaceutical Quality）将该研讨会的内容总结为三个部分：
美国的看法
CDER仿制药办公室（OGD）高级化学家Deyi Zhang主持了以监管为导向的开幕会议，概述了仿制药寡核苷酸的CMC 问题和特定产品指南（PSG）的制定。Zhang介绍了FDA批准的目前可用的寡核苷酸药物，并强调了该药物类别的巨大潜力，同时指出“寡核苷酸面临许多影响仿制药开发的科学和监管挑战”。例如，“没有专门针对寡核苷酸药物质量方面的ICH 或FDA指南。此外，对于杂质 的报告限度 、鉴定限度 或界定限度 也没有共识。”该会议内容总结概述如下：
仿制药，特别是寡核苷酸仿制药开发的关键监管期望
在2023年10月1日起生效的仿制药使用者付费法案（GDUFA ）第III章中，FDA建议在NDA批准后两年内为50%的新复杂产品 （complex products）发布PSG，在NDA 批准后三年内为75%的此类产品发布PSG，这是一项重大的改进。
2022年2月寡核苷酸药物Nusineresen的PSG发布（即诺西那生钠，相关资讯【FDA发布43篇BE指南，新增诺西那生钠指南】 ），这是首个寡核苷酸药物PSG，其关键考虑因素是：API 相似性的证明以及杂质谱 的评估。作为背景，Zhang还描述了寡核苷酸的固相合成，特别强调了硫代磷酸酯的磷手性中心的立体化学可以影响寡核苷酸的药理学 性质，并展示了反应条件（包括活化剂选择）将如何影响合成过程中的硫代磷酸酯立体化学。
为了证明API的相似性，FDA要求仿制药必须证明在一级序列、化学结构和非对映异构体组成方面与RLD 相比具有等效性
可以采用常见的正交分析方法将仿制药API与参比制剂（RLD）的API进行比较，分析方法 包括：质谱 (MS)、MS/MS、核磁（NMR）、液相色谱（LC）和熔解温度（Tm）等。Zhang表明，FDA还希望看到在物理化学性质 方面的等效性，包括API在产品中的聚集状态（aggregation state）或更高阶结构，并概述了可以使用的方法。对于多肽，推荐使用生物活性进行表征，包括体外或动物研究，但不推荐用于寡核苷酸。
欧洲的意见
德国联邦药品和医疗器械 研究所（BfArM）CMC 审查员Rene Thiirmer以欧洲监管机构的视角就CMC经验和对寡核苷酸的期望进行了演讲。Thiirmer的演讲包括：控制策略 开发、杂质问题以及寡核苷酸领域的未来趋势。内容总结概述如下：
控制策略的开发
关于寡核苷酸合成的起始材料，亚磷酰胺比许多小分子API更复杂，其具有复杂的化学和合成，以及连接链（linkers）/偶联物（conjugates）的复杂开发计划。杂质谱 的评估对于寡核苷酸至关重要，Thurmer建议应遵循ICH Q11问答的要求，应比较来自不同供应商的亚磷酰胺的杂质谱。
寡核苷酸表征和质量标准 制定方面的挑战
关于杂质的质量标准，目前没有任何机构具有寡核苷酸杂质的限度。问题在于“纯度是相对的”，对于不同的分析方法 或不同的寡核苷酸是否应该有相同的限度值仍然没有达成共识。Thurmer强调了正交杂质分析的重要性，概述了单链和双链寡核苷酸的分析方法，并就影响因素和鉴别试验（stress and identity testing）以及遗传毒性 和亚硝胺 杂质提出了建议。
关于生物测定，Thurmer指出“通常对于反义分子和siRNA分子，不会进行生物测定。但是应提供省略生物测定的理由。”
与FDA类似，立体化学也是欧洲监管机构的一个问题，“应评估合成过程中立体异构体分布的一致性”。同时还应关注EMA关于最终灭菌 的指南，该指南“提供了最高的无菌保证”。
先验知识、平台技术和抗体偶联物正在向前发展
寡核苷酸领域的先验知识和平台技术都具有巨大的发展潜力。考虑到液体API的使用以及含有辅料的活性物质溶液的监管，过程分析技术（PAT）应用在寡核苷酸制造过程中具有巨大潜力。寡核苷酸偶联物的发展超越了聚乙二醇化和GalNac（N-乙酰化的半乳糖胺）技术，例如使用抗体-寡核苷酸偶联物。这种物质在欧洲被认为是生物制品 ，Thurmer描述了这种分类相应的监管要求。
企业的声音
Astra Zeneca副首席科学家Elaine Fowler就如何使用平台技术加快寡核苷酸产品的开发做了报告，她指出寡核苷酸具有可预测的稳定性 和物理特性以及相对简单的配方和剂型 ，可以实现制造过程和设备组件的标准化。借助大量平台知识，可以对候选分子进行基于科学的风险评估，并考虑API的化学成分、配方 和容器 密封等因素是否符合已积累的平台数据范围。然而，在使用平台数据时，需要考虑监管预期，并确保及时掌握所有正确的数据。此外，Fowler还强调了深入了解寡核苷酸降解途径和杂质的重要性，其可为原料药 稳定性和有效期 、制造工艺和控制策略、制剂开发和储存要求以及分析方法提供信息。
多肽和寡核苷酸的USP标准开发
两位USP专家Julie Zhang和Sarita Acharya对寡核苷酸和多肽的药典标准进行了演讲。Julie Zhang概述了USP标准制定的过程，并强调了多肽各论的最新更新和与多肽有关的最常用的通则，USP-NF共有27个多肽各论和39个标准物质（reference standards）。Sarita Acharya概述了USP的整体生物制品 策略，并讨论了寡核苷酸标准的制定以及USP如何优先考虑寡核苷酸合成的关键起始物料 —亚磷酰胺的标准。内容总结概述如下：
USP多肽各论中相关的质量属性
产品相关杂质 （product-related impurities）
工艺相关杂质（process-related impurities）
特定检测（specific tests）：例如，微生物、内毒素 和水试（water tests）。
无论合成路线如何，可以形成更高阶结构的更长或更复杂的肽可能需要生物活性检测（bioassay test），重组多肽通常需要进行生物鉴别检测（bioidentity test）。虽然化学合成的多肽可以通过物理化学检测进行充分表征，但一些合成多肽产品仍需要进行生物鉴别检测（例如，bivalirudin比伐卢定）。
USP多肽领域的新进展
在USP-NF中发布了新的通则和各论，包括<1503>合成多肽原料药的质量属性（Quality attributes of synthetic peptide drug substances）。
更多通则和各论仍处于开发阶段，已在药典论坛（PF）上发表征询公众意见。其中包括关于多肽合成起始物料的质量属性的通则<1504>。
目前正在对更多各论进行修订，将在随后的PF中出版。
USP优先考虑寡核苷酸合成的关键起始物料—亚磷酰胺
USP在标准开发中优先考虑寡核苷酸合成中最常用的五种亚磷酰胺，Acharya强调了这五种化合物最重要的质量属性：使用质谱进行鉴定，使用磷-31（31P）NMR和HPLC 进行纯度分析。目前，USP在批量采购优先级最高的五种亚磷酰胺，下一阶段将招募实验室进行合作研究，然后将对数据进行审查，并将报告提交给生物制品 专家委员会批准。USP还在考虑其他类型的寡核苷酸产品的亚磷酰胺标准，例如RNA和MOE，目前处于流程开发的早期阶段。此外，USP还在研究用于系统适用性杂质的标准物质。
多肽和寡核苷酸分析、生产和原料的考虑因素
研讨会第二天和第三天讨论了确保多肽/寡核苷酸质量的分析工具，以及生产和原料方面的考虑，在这些讨论中进一步阐明了杂质问题。
FDA通过高分辨率质谱（HRMS）对合成寡核苷酸进行深入杂质分析
CDER科学家Kui Yang重点介绍了使用HRMS方法分析共流出的同量异位素杂质（coeluting isobaric impurities），这是寡核苷酸杂质谱 分析中的一项重大挑战。该方法允许检测和定量同量异位素杂质，如n-C和n-U缺失，以及通过脱氨基作用与全长产物同量异位的杂质。此外，Wave Life制药的Philip Ross介绍了立体化学纯表征的分析策略。Wave Life使用专有的化学方法生成了立体纯寡核苷酸，对于立体纯寡核苷酸，单体（monomers）的控制至关重要，因为其决定了硫代磷酸键的构型。Ross举例说明了磷-31的NMR、旋光度 、使用Sp特异性核酸酶的酶解，以及如何用于表征立体纯、D和L构型的亚磷酰胺。
研讨会委员会成员Nadim Akhtar总结了研讨会第二天的六场演讲，内容总结概述如下：
亚磷酰胺中关键杂质分析方法的开发
Ionis制药的Dennis Rhodes在演讲中强调了分析亚磷酰胺的最大挑战是其含有的大量杂质。杂质分为关键杂质和非关键杂质，与非关键杂质相比，Ionis对关键杂质具有更高的质量标准 限制，因为其被纳入原料药中。对于药品，Ionis开发了一种UHPLC-MS方法，该方法提高了主峰中关键杂质的分离度。与之前使用的HPLC-MSD方法相比有显著的改进。对于化学成分更复杂且杂质更多的cEt亚磷酰胺，对这些碱基进行流动相优化可提高方法性能。
使用LC高分辨率质谱表征多肽中D-氨基酸降解的特性
Hybio制药的Baole Zhang讨论了D-丝氨酸、D-组氨酸和D-天冬氨酸的消旋机制，描述了表征D-氨基酸的四步方法，并通过鉴定semaglutide（索马鲁肽）的手性杂质来说明这一点。
高度修饰的合成RNA的质谱表征方法
Bachem的Giovanni calderisi在演讲中提到超高分辨率质谱是表征修饰的寡核苷酸的理想方法。含有EDTA（乙二胺四乙酸）、烷基胺和HFIP（六氟异丙醇）的液相色谱洗脱液会导致较差的信噪比，但背景扣除（background subtraction）可以提高数据质量。Max Ent（maximum entropy，最大熵）模型可以通过反褶积（deconvolution）简化质谱 。LC-MS/MS也可用于序列确认，但具有挑战性，因为其信号强度较低，难以覆盖全光谱。
寡核苷酸分离色谱技术的评估以及高分辨率质谱在常规检测中的应用
由于主链中的高电荷，寡核苷酸色谱分析非常具有挑战性。Bioge的Andrew Arg认为CS和苯基己基色谱柱可以在速度和分离度方面提供改进。HFIP和乙酸是常见的改性剂（modifiers），其分别在MS质量和LC性能方面具有优势。HILIC在分离ASOs（反义寡核苷酸）方面也越来越受欢迎，尤其是在大型制药企业中。其可以基于大小进行分离，但随着寡核苷酸或杂质的大小增加，分离变得越来越困难。
合成多肽的杂质分析
Lilly的Mark Strege在演讲中介绍了如何使用超高压LC-UV来控制Tirzepatide中的杂质，并将超高压LC-MS用作共洗脱杂质 的互补/正交（complementary/orthogonal）方法。
作者：识林-红木
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